孝感破碎机软启动柜的简单介绍

引用本文: 李晓俊, 李亚, 卞晴晴, 等. 中西医结合治疗对慢性阻塞性肺疾病痰热证急性加重-稳定期大鼠免疫因子的影响研究 [J] . 中国全科医学, 2022, 25(2) : 197-205. DOI: 10.12114/j.issn.1007-9572.2021.01.044.

慢性阻塞性肺疾病（COPD）急性加重期（AECOPD）是COPD管理中的重要事件孝感破碎机软启动柜，严重影响患者的健康状况、疾病进展和住院/再入院率[1]。COPD患者气道表面普遍存在分泌型免疫球蛋白A（sIgA）缺损[2]孝感破碎机软启动柜，与气流阻塞的严重程度相关[3，4]。sIgA介导宿主保护和病原体中和[5]，位于免疫系统抵御病原体的第一道防线。人体胃肠道与呼吸道具有典型的黏膜结构，均能分泌大量sIgA，并通过归巢迁移及共同免疫系统相联系，成为肺与大肠相关性的重要基础[6]。COPD患者肺间质及实质等组织活检[7]发现大量T淋巴细胞聚集现象，表现为CD8+细胞数量增加，CD3+和CD4+细胞数量基本不变或稍降，CD4+/CD8+下降，导致免疫失衡[8]，是COPD发生和发展的关键因素[9，10]。中西医结合治疗COPD可以显著改善患者症状、减少并发症、改善肺通气功能、降低致残率等[11，12]，但中西医结合治疗COPD痰热证急性加重-稳定期对肺组织和肠组织的sIgA、CD3+及CD4+的影响缺乏相关证据。本研究通过观察中西医结合治疗对COPD痰热证急性加重-稳定期大鼠的用力肺活量（FVC）、第0.3秒用力呼气容积（FEV0.3）、FEV0.3/FVC以及肺、肠组织的sIgA、CD3+和CD4+水平产生的影响，明确中西医结合治疗对肺组织和肠组织的免疫屏障功能的修复作用，以期为COPD的中医药诊治提供新思路。

1　材料与方法

1.1　实验动物

2019年9月至2020年12月选取SPF级SD大鼠60只，雌雄各半，体质量（200±20）g，购于济南朋悦实验动物繁育中心〔许可证号孝感破碎机软启动柜：SCXK（鲁）2019-0003〕。

1.2 　香烟

红旗渠牌过滤嘴香烟，硬金红，烤烟型，焦油量10 mg，烟碱量1 mg，烟气一氧化碳含量12 mg，河南中烟工业有限责任公司生产。

1.3　药物

脂多糖（LPS，100 mg，Sigma，USA，使用前用0.9%氯化钠溶液溶解为1 mg/ml）。0.9%氯化钠溶液（500 ml/瓶，河南竹林众生制药股份有限公司）。通塞颗粒（TSG，药物组成为葶苈子15 g、地龙15 g、赤芍12 g、川贝母10 g、生晒参10 g、麦冬15 g、炙麻黄9 g、制大黄6 g、石菖蒲10 g，由河南中医药大学药学院中药制剂实验室鉴定提供，专利号：ZL201010183177.1）。补肺益肾方（BYG，药物组成为黄芪15 g、党参9 g、枸杞子12 g、浙贝母9 g、山茱萸12 g等，制成流浸膏备用，含生药量1.848 g/ml，由河南中医药大学药学院中药制剂实验室鉴定提供，专利号：ZL201110117578.1）。盐酸莫西沙星片（MXF，0.4 g×3 s，拜复乐，拜尔医药保健有限公司，国药准字J20150015）。硫酸沙丁胺醇片（STL，2 mg×100 s，金坛，江苏亚邦爱普森药业有限公司，国药准字H32024535）。

1.4 　试剂和仪器

大鼠酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒和大鼠sIgA（E-EL-R0875c）购于武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，苏木素伊红（HE）染色试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司，石蜡块、二甲苯溶液、无水乙醇和中性树脂购于国药集团，兔抗大鼠多克隆抗体CD3（E-AB-40132）购于武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，兔抗大鼠多克隆抗体CD4（K006374P）购于北京索莱宝科技有限公司，链霉亲和素-碱性磷酸酶（SABC-AP）免疫组化染色试剂盒（SA1055）购于武汉博士德生物工程有限公司。WBP无束缚小动物全身体积描记仪和Fine PointeTM series PFT检测系统购于美国谛思蔼贸易有限公司，烘箱购于上海新苗医疗设备有限公司，BS210S电子天平购于德国赛多利斯集团，LDZ5-2离心机购于美国赛默飞世尔科技有限公司，RM2145自动切片机购于德国徕卡显微系统贸易有限公司，YT-7F8生物组织摊烤片机和YB-6LF生物组织石蜡包埋机购于湖北省孝感市亚光医用电子技术有限公司，PM-10AD光学显微镜及图像采集系统购于日本奥林巴斯销售服务有限公司，IVC-Ⅱ动物饲养笼具购于江苏省苏州市冯氏实验动物设备有限公司。

1.5　实验方法

大鼠适应性饲养7 d，室温（25±1）℃，湿度（50%±10%），换气量（15±5）次/h，氨浓度≤14 mg/m3，噪声≤60 db。12 h昼夜交替照明，自由饮纯水、饲料。采用EXCEL RAND函数法将60只大鼠随机分为对照组、COPD稳定期（COPD）组、AECOPD组、西药组、中西医结合组。每日观察并记录大鼠一般情况，包括皮毛色泽，活动度，灵敏度，进食、进水量等。本实验已通过河南中医药大学第一附属医院伦理委员会审批（批号：YFYDW2018015）。

1.6　模型制备

1.6.1　预实验

采用梯度浓度LPS溶液鼻腔内滴注联合香烟烟雾暴露法制备COPD稳定期-急性加重期模型，热暴露法模拟痰热证。80只大鼠随机分为对照组、LPS 0.5 mg组、LPS 1.0 mg组、LPS 2.0 mg组，每组20只。第0周、第4周、第8周、第12周和模拟急性加重前，检测肺功能并分析数据孝感破碎机软启动柜；第8周、第12周结束时，分批取材观察肺组织病理。除对照组、COPD组外，第13周第1天起，半数模型大鼠进行热暴露并持续9 d，模拟痰热证。第13周第6天，将热暴露的大鼠鼻腔内一次性滴注浓度加倍的LPS模拟急性加重期。第13周第5天起，每日检测所有大鼠肛温，隔日尾静脉采血，检测血常规各指标，血清C反应蛋白（CRP）和血清淀粉样蛋白A（SAA）表达水平至炎性指标恢复至接近COPD稳定期水平。

综合肺组织病理、肛温、CRP和SAA，LPS 1.0 mg组大鼠于第8周末已成功建立COPD稳定期大鼠模型，LPS溶液浓度适宜，大鼠死亡率低。确定COPD稳定期大鼠模型的建立周期为8周，LPS鼻腔内滴注的最佳浓度为1 mg/kg体质量，COPD痰热证急性加重期的LPS最佳浓度为2 mg/kg体质量，急性加重持续时间为6~8 d。该模型的炎症特点、肺功能、肺形态学具有稳定性，适宜用于后续研究。

1.6.2　实验模型

COPD稳定期模型：除对照组外，其余组别给予LPS溶液以1 mg/kg体质量经鼻腔滴入，2次/周，持续8周[13]孝感破碎机软启动柜；对照组大鼠滴入等体积0.9%氯化钠溶液。除对照组外，其余组别均进行香烟烟雾暴露，采用有机玻璃熏烟箱，体积189 L，烟雾浓度（3 000±500）ppm，30 min/次，2次/d，间隔≥3 h，持续8周；对照组大鼠置于通风良好的室内。经鼻腔滴入LPS溶液当天，不进行香烟烟雾暴露。模型成功标准依据预实验及文献[14]。

COPD痰热证急性加重期模型：除对照组、COPD组外，于造模第9周第1天起，将半数模型大鼠置于烘箱进行热暴露，温度（38±1）℃，湿度50%，风速1 m/s，30 min/次，2次/d，间隔≥3 h，持续9 d模拟痰热证[14]。实验第9周第6天给予热暴露的大鼠鼻腔滴入LPS溶液2 mg/kg体质量模拟急性加重期。急性加重当天，不进行热暴露。

1.7　药物干预

西药组、中西医结合组于造模第9周第7天分别灌胃相应药物，急性加重期灌胃持续8 d、稳定期灌胃持续14 d[14]，对照组、COPD组及AECOPD组全程灌胃0.9%氯化钠溶液，各组药物干预计划见表1。药物剂量采用等效剂量系数换算公式计算。D大鼠=D人×（HI大鼠/HI人）×（W人/W大鼠）2/3。注：D为剂量，HI为体型系数，W为体质量。各药物灌胃剂量：通塞颗粒为7.2 g·kg-1·d-1，补肺益肾方为4.42 g·kg-1·d-1，盐酸莫西沙星片为0.027 g·kg-1·d-1，硫酸沙丁胺醇片为0.41 mg·kg-1·d-1；每周称量一次大鼠体质量，以调整灌胃用量。

表1 各组药物干预计划

Table 1 Intervention plans of five groups of rats

1.8　取材与指标检测

药物干预结束后取材，取材前大鼠禁食12 h，自由饮水。采用3%戊巴比妥钠（2.5 ml/kg）腹腔麻醉，气管插管，检测肺功能，随后腹主动脉采血并取材。

1.8.1　体质量

每周称量大鼠体质量（g）。

1.8.2　肺功能造模

第0、1、4、8周和急性加重前分别使用WBP无束缚小动物全身体积描记仪检测潮气量（TV）、呼气峰流速（PEF）、50%潮气量呼气流量（EF50）；取材前使用Fine PointeTM series PFT检测FVC、FEV0.3，计算FEV0.3/FVC。

1.8.3　肺、肠组织CD3+和CD4+表达水平

取左肺经左主支气管恒压灌注10%中性甲醛溶液2 h，然后置于新鲜配制的10%中性甲醛固定液中固定72 h。从肛门向上截取5 cm肠组织，清除其内容物，0.9%氯化钠溶液洗2次，置于新鲜配制的10%中性甲醛固定液中固定72 h。分别切取3 mm组织，石蜡包埋，4 μm切片，常规HE染色。采用免疫组化试剂盒检测CD3+和CD4+表达。

1.8.4　肺、肠组织sIgA表达水平

分别取右肺下叶100 mg组织和100 mg肠组织，用无菌剪剪碎，按1∶9比例加入0.9%氯化钠溶液，放置于组织破碎机10 min进行充分匀浆，3 000 rpm离心10 min（r=5 cm），收集上清液。ELISA试剂盒检测sIgA表达水平。

1.8.5　显微镜观察

每张切片取6个视野（200×），采用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件（USA），以棕黄色区域光密度值（IOD）的平均值统计阳性结果。

1.9　统计学方法

采用GraphPad Prism 7.0软件进行统计并作图。计量资料以（

±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，方差齐时采用Tukey's法进行多重检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　一般情况

对照组大鼠皮毛光滑，活动度正常，反应灵敏，进食量、进水量如常，粪便呈颗粒状；其余组别大鼠皮毛光泽度下降，皮毛色泽偏黄，活动明显减少、敏捷度下降、出现蜷缩现象，进食量、进水量减少，粪便稀溏不成形。药物治疗后的大鼠进食量、进水量增加，中西医结合组大鼠的粪便逐渐形成颗粒状。对照组、COPD组无大鼠死亡，其他组均出现2~3只大鼠死亡，尸检可见死亡大鼠胸腔出现不同程度的肺淤血、肺体积增大，腹腔出现不同程度的粘连、血性积液。

2.2　体质量

各组大鼠体质量随周龄增长，其他组别体质量全程低于对照组。第9周急性加重后，AECOPD组持续低增长，见图1A。干预结束后，五组体质量比较，差异有统计学意义（F=88.74，P<0.05）。COPD组体质量低于对照组，差异有统计学意义（q=16.320，P<0.05）；AECOPD组体质量低于COPD组，差异有统计学意义（q=8.925，P<0.05）；西药组、中西医结合组体质量高于AECOPD组，差异有统计学意义（q西药组=9.026，q中西医结合组=10.430，P<0.05）；西药组、中西医结合组体质量比较，差异无统计学意义（q=1.912，P>0.05），见图1B。

图1 各组大鼠体质量变化

Figure 1 Body weight change of rats in each group

2.3　肺功能

第0~8周，对照组大鼠的TV、PEF、EF50随时间增长，其他组别TV、PEF、EF50全程低于对照组，见图2A~C。第8周结束时，COPD组、AECOPD组、西药组、中西医结合组的TV、PEF、EF50低于对照组，差异有统计学意义（FTV=17.00，FPEF=43.69，FEF50=13.54，P<0.05）；COPD组、AECOPD组、西药组、中西医结合组TV、PEF、EF50比较，差异无统计学意义（P>0.05），见图2D~F。

图2 各组大鼠肺功能变化比较

Figure 2 Changes of lung function of rats in each group

药物干预结束时，五组大鼠的FEV0.3比较，差异有统计学意义（F=155.70，P<0.05）。COPD组FEV0.3低于对照组，差异有统计学意义（q=20.070，P<0.05）；AECOPD组FEV0.3低于COPD组，差异有统计学意义（q=11.310，P<0.05）；西药组、中西医结合组FEV0.3高于AECOPD组，差异有统计学意义（q西药组=16.750，q中西医结合组=24.890，P<0.05）；中西医结合组FEV0.3高于西药组，差异有统计学意义（q=9.272，P<0.05），见图2G。

药物干预结束时五组大鼠FVC比较，差异有统计学意义（F=83.73，P<0.05）。COPD组FVC低于对照组，差异有统计学意义（q=16.190，P<0.05）；AECOPD组FVC低于COPD组，差异有统计学意义（q=7.336，P<0.05）；西药组、中西医结合组FVC高于AECOPD组，差异有统计学意义（q西药组=13.040，q中西医结合组=17.640，P<0.05）；中西医结合组FVC高于西药组，差异有统计学意义（q=5.597，P<0.05），见图2H。

药物干预结束时五组大鼠FEV0.3/FVC比较，差异有统计学意义（F=123.00，P<0.05）。COPD组FEV0.3/FVC低于对照组，差异有统计学意义（q=10.560，P<0.05）；AECOPD组FEV0.3/FVC低于COPD组，差异有统计学意义（q=16.630，P<0.05）；西药组、中西医结合组FEV0.3/FVC高于AECOPD组，差异有统计学意义（q西药组=17.400，q中西医结合组=25.500，P<0.05）；中西医结合组FEV0.3/FVC高于西药组，差异有统计学意义（q=9.275，P<0.05），见图2I。

2.4　肺组织和肠组织sIgA表达水平

五组大鼠的肺组织sIgA表达水平比较，差异有统计学意义（F=700.20，P<0.05）。COPD组大鼠肺组织sIgA表达水平低于对照组，差异有统计学意义（q=50.030，P<0.05）；AECOPD组肺组织sIgA表达水平低于COPD组，差异有统计学意义（q=19.260，P<0.05）；西药组、中西医结合组肺组织sIgA表达水平高于AECOPD组，差异有统计学意义（q西药组=10.580，q中西医结合组=16.000，P<0.05）；中西医结合组肺组织sIgA表达水平高于西药组，差异有统计学意义（q=5.072，P<0.05），见图3A。

图3 各组大鼠sIgA表达水平比较

Figure 3 Expression of sIgA in rats of each group

五组大鼠的肠组织sIgA表达水平比较，差异有统计学意义（F=1 113.00，P<0.05）。COPD组大鼠肠组织sIgA表达水平低于对照组，差异有统计学意义（q=43.460，P<0.05）；AECOPD组肠组织sIgA表达水平低于COPD组，差异有统计学意义（q=49.970，P<0.05）；西药组、中西医结合组肠组织sIgA表达水平高于AECOPD组，差异有统计学意义（q西药组=26.470，q中西医结合组=34.530，P<0.05）；中西医结合组肠组织sIgA表达水平高于西药组，差异有统计学意义（q=9.359，P<0.05），见图3B。

2.5　肺组织CD3+和CD4+表达水平

五组大鼠的肺组织CD3+表达水平比较，差异有统计学意义（F=96.39，P<0.05）。COPD组大鼠肺组织CD3+表达水平低于对照组，差异有统计学意义（q=15.700，P<0.05）；AECOPD组肺组织CD3+表达水平低于COPD组，差异有统计学意义（q=12.980，P<0.05）；西药组、中西医结合组肺组织CD3+表达水平高于AECOPD组，差异有统计学意义（q西药组=12.690，q中西医结合组=16.120，P<0.05）；中西医结合组肺组织CD3+表达水平高于西药组，差异有统计学意义（q=5.654，P<0.05），见图4A，图4C~G。

图4 各组大鼠肺组织CD3+和CD4+表达水平比较

Figure 4 Expression of CD3+ and CD4+ in lung tissue of rats in each group

五组大鼠的肺组织CD4+表达水平比较，差异有统计学意义（F=418.80，P<0.05）。COPD组大鼠肺组织CD4+表达水平低于对照组，差异有统计学意义（q=34.140，P<0.05）；AECOPD组肺组织CD4+表达水平低于COPD组，差异有统计学意义（q=23.150，P<0.05）；西药组、中西医结合组肺组织CD4+表达水平高于AECOPD组，差异有统计学意义（q西药组=12.760，q中西医结合组=16.160，P<0.05）；西药组、中西医结合组肺组织CD4+表达水平比较，差异无统计学意义（q=3.776，P>0.05），见图4B，图4H~L。

2.6　肠组织CD3+和CD4+表达水平

五组大鼠的肠组织CD3+表达水平比较，差异有统计学意义（F=174.10，P<0.05）。COPD组大鼠肠组织CD3+表达水平低于对照组，差异有统计学意义（q=23.510，P<0.05）；AECOPD组肠组织CD3+表达水平低于COPD组，差异有统计学意义（q=13.910，P<0.05）；西药组、中西医结合组肠组织CD3+表达水平高于AECOPD组，差异有统计学意义（q西药组=8.498，q中西医结合组=11.460，P<0.05）；西药组、中西医结合组肠组织CD3+表达水平比较，差异无统计学意义（q=3.288，P>0.05），见图5A，图5C~G。

图5 各组大鼠肠组织CD3+和CD4+表达水平比较

Figure 5 Expression of CD3+ and CD4+ in intestinal tissue of rats in each group

五组大鼠的肠组织CD4+表达水平比较，差异有统计学意义（F=90.66，P<0.05）。COPD组大鼠肠组织CD4+表达水平低于对照组，差异有统计学意义（q=18.800，P<0.05）；AECOPD组肠组织CD4+表达水平低于COPD组，差异有统计学意义（q=11.320，P<0.05）；西药组、中西医结合组肠组织CD4+表达水平高于AECOPD组，差异有统计学意义（q西药组=10.430，q中西医结合组=13.240，P<0.05）；西药组、中西医结合组肠组织CD4+表达水平比较，差异无统计学意义（q=3.348，P>0.05），见图5B，图5H~L。

3　讨论

本实验的模型组大鼠皮毛光泽度下降，皮毛色泽偏黄，表现出活动明显减少、敏捷度下降、蜷缩现象，进食量、进水量减少，体质量增长速度缓慢，粪便稀溏不成形。药物治疗后的大鼠进食量、进水量增加，体质量较AECOPD组大鼠显著增长，粪便逐渐形成颗粒状。临床重度和极重度COPD的常见症状包括腹胀便溏、形体消瘦、倦怠无力等[15，16]，对判断预后具有重要价值[17]。肌肉量降低的COPD患者，在院内死亡率、住院天数、住院费用方面显著高于非肌肉量降低的患者[18]。以上研究结果提示，中西医结合治疗COPD痰热证急性加重-稳定期大鼠，能够通过提高大鼠的进食、进水量，促进大鼠体质量增长，通过改善粪便状态，缓解大鼠腹泻表现，从而改善大鼠的生存质量。

本实验于第8周结束后，模型组大鼠的TV、PEF、EF50显著低于对照组；取材前，AECOPD组大鼠的FVC、FEV0.3和FEV0.3/FVC显著低于西药组和中西医结合组，且中西医结合组疗效更显著。COPD的特点是持续的呼吸道症状和气流受限，临床中的肺功能检测是对气流限制最具重复性和客观性的测量方法[1]。本实验中，模型大鼠的肺功能相关指标降低与临床研究肺功能的变化一致，提示中西医结合治疗COPD痰热证急性加重-稳定期，能够通过提高肺功能从而改善大鼠的呼吸功能。

本实验中，AECOPD组大鼠肺组织和肠组织中的sIgA表达水平显著低于对照组，药物治疗可使肺组织和肠组织中sIgA表达水平升高，中西医结合治疗组的sIgA表达水平升高更显著。COPD患者气道表面普遍存在sIgA表达缺损[2]，与慢性细菌侵袭、中性粒细胞炎症及COPD气流阻塞的严重程度相关[3，4]。当呼吸道感染时，病原微生物入侵并黏附于上皮，刺激黏膜局部产生免疫应答，并通过黏膜免疫归巢迁移的途径影响传变到肠道，使肺和肠道的sIgA的合成与分泌减少，黏膜局部抗感染能力较弱，又增加肺部病变。慢性炎症与免疫机制相互交织，相互促进，形成恶性循环[19]。中西医结合治疗COPD痰热证急性加重-稳定期大鼠，能够显著升高大鼠肺组织和肠组织中的sIgA表达水平，从而改善肺组织和肠组织的免疫屏障功能。

本实验显示，各模型组大鼠肺、肠组织CD3+和CD4+表达水平显著低于对照组，西药组、中西医结合组大鼠肺组织和肠组织的CD3+和CD4+表达水平显著高于AECOPD组，中西医结合组肺组织CD3+表达水平升高更显著。COPD患者肺间质及实质等组织活检[7]发现了大量T淋巴细胞和巨噬细胞聚集现象，主要炎症表现为CD8+细胞数量增加，CD3+和CD4+细胞数量基本不变或稍降，CD4+/CD8+下降，导致免疫失衡[8]。文献报道的COPD患者外周血和支气管肺泡灌洗液中T淋巴细胞亚群异常，气道中性粒细胞、巨噬细胞和CD8+T淋巴细胞增多，即使停止吸烟后，T淋巴细胞介导的异常肺内炎症仍持续存在，是COPD发生和发展的关键因素[9，10]。本研究结果与临床研究表现一致，提示中西医结合治疗COPD痰热证急性加重-稳定期，可能通过改善大鼠T淋巴细胞的表达，提高免疫水平、延缓COPD疾病进程。

综上所述，本研究采用中西医结合治疗COPD痰热证急性加重-稳定期大鼠，上调了肺组织和肠组织sIgA、CD3+和CD4+的表达水平，表明了通塞颗粒/补肺益肾方联合西药治疗COPD急性加重-稳定期大鼠可能通过提高大鼠肺组织和肠组织sIgA、CD3+和CD4+的表达水平，修复肺组织和肠组织的免疫屏障功能，提高大鼠免疫力。由于缺乏中西医结合治疗对COPD痰热证急性加重-稳定期肺、肠组织sIgA、CD3+和CD4+表达水平影响的相关证据，本研究填补了该研究领域的空白，为中医药防治COPD的深入研究提供参考依据。

利益冲突

本文无利益冲突。

参考文献 略